Gel electrophoresis là gì
|
Kỹ thuật điện di ngang trên gel agarose là gì?Điện di ngang trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được sử dụng chủ yếu để phân tách DNA trong mẫu dựa trên kích thước, kỹ thuật này cũng được sử dụng để phân tách RNA hoặc protein.Bạn đang xem: Electrophoresis là gì Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật điện di ngangPhân tử DNA được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khung sườn (backbone) từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate. Theo cấu trúc này, mỗi một nucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỷ lệ thuận với khối lượng (mass-to-charge). Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện trường có thể khiến DNA di chuyển về phía điện cực dương. Bạn đang xem: Electrophoresis là gì Hình 1. Cấu tạo của phân tử DNA Hình 2. Mô tả cách thức hoạt động của kỹ thuật điện di ngang Một số ứng dụng của kỹ thuật điện di trên gel agarose1) Trong tạo dòng (cloning): Điện di DNA là bước quan trọng trong quy trình tạo dòng, giúp nhà nghiên cứu phân tích sản phẩm PCR hoặc DNA sau khi xử lý với enzyme cắt giới hạn (RE). Ngoài ra, điện di cũng cho phép thu hồi đoạn DNA mong muốn từ gel agarose.2) Dấu ấn di truyền (genetic fingerprinting): là kỹ thuật kết hợp việc PCR và điện di các trình tự lặp lại ngắn trên bộ gene. Những trình tự này sẽ có số lần lặp lại khác nhau ở các cá thể khác nhau, dẫn đến sự khác biệt về kích thước sản phẩm PCR và có thể nhận biết thông qua điện di.3) Trong chẩn đoán (diagnostic): điện di DNA là bước không thể thiếu trong quy trình xét nghiệm bệnh lý bằng PCR, từ bệnh di truyền cho đến các bệnh truyền nhiễm. Xem thêm: The Atom Là Ai N Atom Là Ai N Atom, Captain Atom Là Ai Các hệ thống điện di ngang của kulturbench.com 1) Bộ điện di ngang runVIEW Realtime 2) Hệ thống điện di ngang - gelLITE Complete Mini agarose gel documentation kit with gelLITE là hệ thống điện di ngang của hãng Cleaver Scientific (UK), được trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất cần thiết để điện di, chụp ảnh và phân tích gel agarose. Hệ thống chụp ảnh gelLITE sử dụng camerra 5 mega pixels phù hợp để chụp ảnh gel DNA, protein, huỳnh quang, so màu (colourmetric). 3) Hệ thống điện di ngang - gelONE 4) Hệ thống điện di ngang - gelPRO Complete Maxi agarose gel documentation kit with gelPRO là hệ thống điện di ngang cỡ lớn của hãng Cleaver Scientific (UK), được trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất cần thiết để điện di, chụp ảnh và phân tích gel agarose. Hệ thống chụp ảnh gelPRO sử dụng camerra 5 mega pixels phù hợp để chụp ảnh gel DNA, protein, huỳnh quang, so màu (colourmetric). Có thể nâng cấp hệ thống gelPRO để chụp ảnh phát quang hóa học (chemiluminescence) hoặc huỳnh quang RGB.
Điện di DNA trên gel agarose là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách và phát hiện những đoạn DNA ( hoặc những đại phân tử khác, ví dụ điển hình như RNA và protein ) dựa trên size và điện tích của chúng. Kỹ thuật này được sử dụng trong tiến trình phối hợp với kỹ thuật PCR ( polymerase chain reaction ), ứng dụng trong nhiều nghành nghề dịch vụ khác nhau. Các ứng dụng nổi bật hoàn toàn có thể kể đến là định danh thành viên trong pháp y, tạo dòng gien, phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, chẩn đoán ung thư, phát hiện bệnh truyền nhiễm trên người, v.v … Những lưu ý thường gặp trong điện di DNA trên gel agarose
Bạn đang đọc: Các lưu ý khi điện di DNA trên gel agarose Khả năng phân tách: Điện di DNA trên gel agarose phù hợp để phân tách các đoạn DNA dài từ 1kb trở xuống. Với những đoạn DNA ngắn hơn 0.1kb, nên sử dụng gel polyacrylamide. Lựa chọn dung dịch đệm: Dung dịch đệm TAE (Tris-Acetic-EDTA) phù hợp phân tách các đoạn lớn hơn 4kb. Đối với những đoạn dài 0.1 – 3kb, nên sử dụng dung dịch đệm TBE (Tris-Borate-EDTA). Dung dịch TBE có khả năng đệm cao hơn và độ dẫn điện cũng thấp hơn dung dịch TAE. Vì vậy, nên sử dụng điện thế cao khi điện di với dung dịch TBE. Ngoài ra, dung dịch TBE tạo ra ít nhiệt lượng hơn so với TAE ở cùng điện thế và không gây lệch pH đáng kể trong quá trình điện di. Nhiệt độ: Điện di DNA trên gel agarose ở điện thế cao sẽ sinh ra nhiệt. Dung dịch đệm có độ dẫn điện cao như TAE sẽ tạo ra nhiều nhiệt hơn so với dung dịch có độ dẫn điện thấp. Khi điện di với điện thế cao hơn 175 volt nên cẩn thận vì nhiệt lượng hình thành có thể gây ra hiện tượng đường chạy hình chữ S, không thể lấy được kết quả. Ngoài ra, chạy điện di với điện thế cao trong thời gian dài có thể gây chảy miếng gel. Khi chạy điện di DNA trên agarose ở điện thế cao, tránh dùng các loại agarose có điểm nóng chảy thấp. Hiệu quả phân tách: Nồng độ gel, dung dịch đệm, điện thế, nhiệt độ, cấu hình nucleic acid và sự hiện diện của ethidium bromide đều ảnh hưởng đến kết quả phân tách. Đối với trường hợp phân tách DNA mạch đôi, ethidium bromide thường được cho vào dung dịch đệm ở nồng độ 0.5 ug/ml. Lưu ý rằng ethidium bromide sẽ làm chậm tốc độ di chuyển DNA khoảng 15%. Một cách khác, sau khi điện di kết thúc, có thể nhuộm miếng gel với dung dịch ethidium bromide 0.5ug/ml (trong nước) trong vòng 15 – 60 phút và quan sát dưới đèn UV. Lưu ý: nên giới hạn thời gian nhuộm để hạn chế các đoạn DNA nhỏ khuếch tán ra khỏi gel.
Xem thêm: Media publications là gì Có thể giảm tín hiệu huỳnh quang nền do ethidium bromide tự do gây ra bằng cách giải nhuộm ( ngâm gel trong dung dịch MgCl2 trong 5 phút hoặc trong nước khử ion trong 30 phút ) Chụp ảnh gel: Khi chụp ảnh gel, những miếng gel mỏng (2-3mm) với nồng độ agarose thấp sẽ cho kết quả đẹp hơn những miếng gel dày hoặc có nồng độ agarose cao. Bảo vệ sức khỏe khi điện di DNA trên gel agaroseEthidium bromide là chất gây ung thư. Luôn luôn đeo găng tay khi thao tác quá trình điện di DNA trên gel agarose có sử dụng ethidium bromide. Đeo kính chắn UV và tìm cách bảo vệ da khi dùng đèn soi UV. Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình điện di DNA trên gel agarose qua video sau (có phụ đề Việt ngữ) [youtube-subtitles width=”640″ height=”360″ id=”vq759wKCCUQ” sub=”www.sinhhocphantu.net/wp-content/uploads/subtitles/Agarose Gel Electrophoresis – YouTube.srt”]
Xem thêm: CHIẾN LƯỢC PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM LÀ GÌ? 29,510 total views, 14 views today
Source: https://chickgolden.com
Agarose gel electrophoresis là phương pháp điện di gel được sử dụng trong hóa sinh, sinh học phân tử, di truyền học và hóa học lâm sàng để phân tách một hỗn hợp các đại phân tử như DNA hoặc các protein trong một ma trận agarose, một trong hai thành phần chính của thạch. Các protein này có thể được phân tách bằng điện tích và / hoặc kích cỡ (điện di agarose tập trung kích thước cơ bản là kích thước độc lập), và các đoạn DNA và RNA theo chiều dài . Các phân tử sinh học được tách ra bằng cách sử dụng điện trường để di chuyển các phân tử tích điện qua một ma trận agarose, và các phân tử sinh học được phân tách theo kích thước trong ma trận gel agarose. Agarose gel dễ dàng đúc, có các nhóm tích điện tương đối ít và đặc biệt thích hợp để tách ADN với phạm vi kích thước thường gặp nhất trong phòng thí nghiệm, điều này làm cho tính phổ biến của việc sử dụng nó. DNA tách ra có thể được nhìn thấy với vết bẩn, thông thường dưới ánh sáng UV, và các đoạn DNA có thể được chiết xuất từ gel dễ dàng tương đối. Hầu hết các gel agarose được sử dụng là giữa 0,7-2% hòa tan trong một buồng điện di phù hợp. Thuộc tính của gel agarose Gel agarose đúc trong khay dùng cho điện di gel Agarose gel có kích thước lỗ chân lông lớn và độ bền gel tốt, làm cho nó thích hợp như một phương tiện chống nong cho quá trình điện di của DNA và các phân tử protein lớn. Kích thước lỗ của 1% gel đã được ước lượng từ 100 nm đến 200-500 nm,và gel gel cho phép gel pha loãng như 0,15% để tạo thành một tấm cho gel điện di.Tuy nhiên, gel có nồng độ thấp (0.1 – 0.2%) rất mỏng manh và do đó rất khó xử lý. Agarose gel có khả năng phân giải thấp hơn so với gel polyacrylamide cho DNA nhưng có khoảng cách lớn hơn, và do đó được sử dụng cho các đoạn DNA có kích thước thường từ 50 đến 20.000 bp. Hạn chế độ phân giải cho điện di agarose gel chuẩn là khoảng 750 kb, nhưng độ phân giải trên 6 Mb có thể thực hiện được bằng điện di gel trường xung (PFGE). Nó cũng có thể được sử dụng để tách các protein lớn, và nó là ma trận được ưu tiên cho điện di gel của các hạt có bán kính hiệu dụng lớn hơn 5-10 nm. Một gel agarose 0,9% có lỗ chân lông đủ lớn để xâm nhập vào bacteriophage T4. Polyme agarose chứa các nhóm tích điện, đặc biệt là pyruvate và sulfat. Các nhóm tích điện âm này tạo ra dòng nước theo hướng đối nghịch với chuyển động của DNA trong quá trình gọi là electroendosmosis (EEO) và do đó có thể làm chậm sự di chuyển của DNA và làm mờ các dải. Gel tập trung cao hơn sẽ có dòng điện cực cao. Vì thế, agarose EEO thấp thường được ưa thích để sử dụng trong quá trình điện di axit nucleic của agarose, nhưng agarose EEO cao có thể được sử dụng cho các mục đích khác. Hàm lượng sulfat thấp của agarose EEO thấp, đặc biệt là agarose LMP (low-melting point), cũng có ích trong trường hợp DNA chiết xuất từ gel sẽ được sử dụng để thao tác thêm nữa vì sự hiện diện của chất sulfat bị ô nhiễm có thể ảnh hưởng đến một số quy trình tiếp theo, như ligation và PCR. Tuy nhiên, agarose Zero EEO rất không mong muốn đối với một số ứng dụng vì chúng có thể được tạo ra bằng cách cho các nhóm tích điện dương và những nhóm như vậy có thể ảnh hưởng đến các phản ứng enzym tiếp theo . Thấu kính điện giải là một lý do khiến agarose được sử dụng thay vì agar vì thành phần agaropectin trong thạch chứa một lượng đáng kể các nhóm sunfat và carboxyl. Việc loại bỏ agaropectin trong agarose làm giảm đáng kể EEO, cũng như giảm sự hấp phụ không phụ thuộc của các phân tử sinh học vào ma trận gel. Tuy nhiên, đối với một số ứng dụng như điện di của protein huyết thanh, một EEO cao có thể là mong muốn, và agaropeptin có thể được thêm vào gel được sử dụng
|
