Môi trường MS pha sẵn, hay còn gọi là Murashige and skoog medium. Có đầy đủ khoáng đa lượng, vi lượng, vitamins. Môi trường rất giàu dinh dưỡng dành cho các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật
Giá môi trường MS vitamins pha sẵn
Xem khách hàng SBC đã thành công như thế nào khi sử dụng môi trường MS vitamins pha sẵn tại SBC Scientific
Môi trường MS được coi như là một môi trường cơ bản, được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật. MSO được phát minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige và Skoog Folke K. vào năm 1962 trong quá trình tìm kiếm của Murashige cho một loại hormone mới . Một số đằng sau các chữ cái MS được sử dụng để chỉ ra nồng độ sucrose của môi trường. Ví dụ MS0 không chứa sucrose và MS20 có chứa 20 g / l sucrose. Trong quá trình tìm hiểu một loại hormone, học trò của Skoog là Murashige tìm kiếm từ nước ép cây thuốc lá. Kết quả không có gì. Nhưng từ nước ép cây thuốc lá ông đã phát hiện được hàm lượng cao khoáng chất trong nước và tro của cây thuốc lá. Một loạt các thí nghiệm đã chứng minh rằng việc thay đổi nồng độ của các chất dinh dưỡng tăng cường sự tăng trưởng đáng kể so với công thức MS hiện có. Ông xác định được rằng nitơ ảnh hưởng quan trọng đến dự tăng trưởng phát triển của cây. Từ đó các môi trường phong phú khác được phát triển dựa trên MS như: Môi trường MS có bổ sung Vitamin, MS bổ sung Vitamin SH, MS bổ sung vitamin B5, MS bổ sung vitamin Nitsch, MS Med. fined Nagasawa.
Các thành phần vi lượng, đa lượng trong môi trường MS như sau:
Thành phần vi lượng mg/l µM CoCl2.6H2O 0.025 0.11 CuSO4.5H2O 0.025 0.10 FeNaEDTA 36.70 100.00 H3BO3 6.20 100.27 KI 0.83 5.00 MnSO4.H2O 16.90 100.00 Na2MoO4.2H2O 0.25 1.03 ZnSO4.7H2O 8.60 29.91 Thành phần đa lượng mg/l mM CaCl2 332.02 2.99 KH2PO4 170.00 1.25 KNO3 1900.00 18.79 MgSO4 180.54 1.50 NH4NO3 1650.00 20.61 Vitamins mg/l µM Glycine 2.00 26.64 myo-Inositol 100.00 554.94 Nicotinic acid 0.50 4.06 Pyridoxine HCl 0.50 2.43 Thiamine HCl 0.10 0.30
Như ta thấy môi trường MS pha sẵn rất tiện lợi. Theo phương pháp pha môi trường truyền thống ta pha các stock cơ bản và trữ lạnh. Theo thời gian các stock vi lượng đa lượng không còn tốt nữa. MS pha sẵn có đủ các stock như trên. Do đó khi ta dùng MS pha sẵn sẽ lợi thời gian và công sức. Sau khi pha, chúng ta bảo quản rất dễ dàng. Môi trường MS pha sẵn có 2 dạng đó là bột và nước. Ở dạng bột, hiện tại hãng đang được sử dụng phổ biến đó là Duchefa, SIGMA. Hãng Duchefa, mỗi lần pha chỉ cần lấy 4,4g cho 1 Lít nước. Ở dạng nước, Hãng Hi-Media tích hợp MS theo dạng stock. Thông thường, mỗi lần lấy 1ml MS cho 1L môi trường.
Hiện nay môi trường MS pha sẵn được sử dụng cho sản xuất cây chuối mô, tiêu, đinh lăng, cây vani,lan,… Mỗi lần pha ta chỉ bổ sung thêm than hoạt tính, kích thích tố hay hormone điều hòa sinh trưởng và điều chỉnh PH.
Phần được nuôi cấy được gọi là explant, tức là, bất kỳ phần nào của cây được lấy ra và trồng trong ống nghiệm, trong điều kiện vô trùng trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt. Trên thực tế, toàn bộ cây có thể được tái sinh từ bất kỳ bộ phận nào của cây [gọi là referred to as explant] hoặc cells. Gottlieb Haberlandt bắt đầu kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1902.
Hormone được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật:
1. Aoxin neoline [Indole-3-acetic acid, Indole-3-butyric acid, Kali Salt muối Naphthalene acetic acid 2, axit 4-Dichlorophenoxyacetic p-chloro-phenoxy acetic]
2. Cytokinin [6-Benzylaminopurine, 6-Dimethylallylaminopurine [2ip], Kinetin]
3. Gibberellin [Axit Gibberellic]
4. Axit Abscisic [ABA] [Axit Abscisic]
5. Polyamines [Putrescine, Spermidine]
Điều kiện môi trường nuôi cấy mô
Có ba khía cạnh quan trọng trong ống nghiệm [bên ngoài th5555454e sinh vật sống và trong môi trường nhân tạo] đó là:
[i] môi trường dinh dưỡng,
[ii] điều kiện vô trùng và
[iii] sục khí của mô.
1. Chất dinh dưỡng trung bình:
Thành phần của môi trường nuôi cấy mô thực vật có thể thay đổi tùy thuộc vào loại mô thực vật hoặc tế bào được sử dụng để nuôi cấy. Một chất dinh dưỡng điển hình [tổng quát] bao gồm các muối vô cơ [cả nguyên tố vi mô và vĩ mô], nguồn carbon [thường là sucrose], vitamin [ví dụ, axit nicotonic, thiamine, pyridoxine và myoinositol], axit amin [ví dụ: arginine] và chất điều hòa tăng trưởng [ví dụ, các chất bổ trợ như 2,4-D hoặc 2,4-dichlorophenoxyacetic acid và cytokinin như BAP = benzlaminopurine và gibberellin]. Các hợp chất khác như casein hydrolyzate, nước cốt dừa, chiết xuất mạch nha, chiết xuất men, nước ép cà chua, vv có thể được thêm vào cho các mục đích cụ thể. Hormon thực vật đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và biệt hóa của các tế bào và mô nuôi cấy. Độ pH tối ưu [thường là 5,7] cũng rất quan trọng. Môi trường dinh dưỡng được sử dụng rộng rãi nhất là môi trường MS được Murashige và Skoog phát triển vào năm 1962. Thông thường, một chất keo agar [một loại polysacarit thu được từ tảo đỏ Gelidium amansi] được thêm vào môi trường lỏng để hóa rắn.
2. Điều kiện vô trùng [tiệt trùng]:
Môi trường dinh dưỡng chứa đường phong phú làm tăng sự phát triển của vi sinh vật như vi khuẩn và nấm. Những vi khuẩn này cạnh tranh với mô đang phát triển và cuối cùng giết chết nó. Nó là điều cần thiết để duy trì điều kiện vô trùng của nuôi cấy mô. Do đó, khử trùng có nghĩa là tiêu diệt hoàn toàn hoặc tiêu diệt vi sinh vật để các điều kiện vô trùng hoàn toàn được tạo ra để nuôi cấy in vitro. Đây cũng là một trong những bước quan trọng mà người ta thường đưa vào quá trình chuyển giao công nghệ trồng đông trùng hạ thảo, hay quá trình thực hành nuôi lan cấy mô…
3. Sục khí của mô:
Sục khí đúng cách của mô nuôi cấy cũng là một khía cạnh quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy. Nó đạt được bằng cách thỉnh thoảng khuấy môi trường bằng cách choáng hoặc bằng máy lắc tự động.
Nguyên liệu thực vật Gạc giải thích: Bất kỳ một phần của một nhà máy đưa ra và trưởng thành trong ống nghiệm dưới điều kiện vô trùng trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt được gọi là mẫu cấy.'
Phương pháp nuôi cấy mô thực vật:
Nuôi cấy mô thực vật bao gồm hai phương pháp chính: [A] Loại nuôi cấy in vitro - mô sẹo và huyền phù. [B] Loại hình nuôi cấy tế bào đơn explant-, bắn và nền văn hóa gốc, văn hóa soma phôi, văn hóa mô phân sinh, nuôi cấy bao phấn và sản xuất đơn bội, văn hóa kiểu mẫu đầu tiên và lai soma, nuôi cấy phôi, văn hóa noãn, văn hóa buồng trứng vv .
Các loại nuôi cấy mô thực vật:
Văn hóa Callus và đình chỉ:
Trong nuôi cấy mô sẹo, sự phân chia tế bào trong explant tạo thành một mô sẹo. Callus là khối lượng không đều có tổ chức và không phân biệt của các tế bào phân chia tích cực. Bóng tối và môi trường rắn được đánh dấu bởi agar kích thích sự hình thành mô sẹo. Môi trường thường chứa các chất phụ trợ, 2,4-D, [2, 4- dichlorophenoxy acetic] và thường là một cytokinin như BAP [Benzyl aminopurine]. Cả hai đều là chất điều hòa tăng trưởng. Điều này kích thích tế bào phân chia trong thám hiểm. Callus thu được trong vòng 2-3 tuần. Nuôi cấy huyền phù bao gồm các tế bào đơn và các nhóm tế bào nhỏ lơ lửng trong môi trường lỏng. Thông thường, môi trường có chứa 2,4-D. Nuôi cấy huyền phù phải được khuấy trộn liên tục ở tốc độ 100-250 vòng / phút [vòng quay mỗi phút]. Nuôi cấy huyền phù phát triển nhanh hơn nhiều so với nuôi cấy mô sẹo.
Nuôi cấy phụ:
Nếu nuôi cấy mô được giữ trong cùng một bình nuôi cấy, chúng sẽ chết theo thời gian. Do đó, các tế bào / mô thường xuyên được chuyển vào các bình nuôi cấy mới chứa môi trường tươi. Quá trình này được gọi là nuôi cấy phụ. Điều quan trọng cần lưu ý là trong quá trình văn hóa nhóm; chỉ một phần của văn hóa từ một tàu được chuyển vào tàu nuôi cấy mới. Nuôi cấy mô sẹo và huyền phù có thể được sử dụng để đạt được sản xuất sinh khối tế bào, tái sinh cây con, sản xuất cây chuyển gen và phân lập protoplast. Nuôi cấy tế bào đơn [Nhân bản tế bào]: Như đã nêu trước đó, các tế bào có nguồn gốc từ một tế bào thông qua nguyên phân đã tạo thành một dòng vô tính và quá trình thu được các dòng vô tính được gọi là nhân bản vô tính [thế hệ con vô tính của một cá thể tạo thành một dòng vô tính]. Có hai kỹ thuật phổ biến cho nuôi cấy tế bào đơn.
1. Kỹ thuật mạ Bergmann từ:
Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi. Các tế bào được treo trong một môi trường lỏng ở mật độ tế bào gấp hai lần mật độ mong muốn trong tấm. Môi trường agar tiệt trùng [Ca 1%] được giữ trong mạch nước ở 35 ° C. Các thể tích bằng nhau của môi trường lỏng và môi trường thạch được trộn và lan truyền trong lớp dày Ca 1 mm trong một petridish. Các tế bào vẫn được nhúng trong môi trường thạch mềm có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Khi các thuộc địa lớn phát triển, chúng được phân lập và nuôi cấy riêng.
2. Kỹ thuật lọc giấy Raft Nurse Tissue Technique:
Các ô đơn được đặt trên các mảnh giấy nhỏ [8 × 8 mm], được đặt trên đỉnh của các mẫu nuôi cấy trước vài ngày. Điều này cho phép các giấy lọc được làm ướt bởi các mô sẹo. Các tế bào đơn được đặt trên giấy lọc lấy nguồn dinh dưỡng của chúng từ mô sẹo. Các tế bào phân chia và hình thành các khuẩn lạc vĩ mô trên các bộ lọc. Các thuộc địa được phân lập và nuôi cấy.
Văn hóa bắn và rễ:
Văn hóa bắn được quảng bá bởi một cytokinin như BAR Tuy nhiên; nuôi cấy rễ được thúc đẩy bởi một chất phụ trợ như NAA [axit axetic naphthalene]. Việc nuôi cấy chồi và rễ thường được kiểm soát bởi sự cân bằng của auxin-cytokinin. Thông thường, sự dư thừa của auxin thúc đẩy nuôi cấy rễ, trong khi đó của cytokinin thúc đẩy nuôi cấy chồi. Rễ nuôi cấy từ đầu dưới của những chồi này để cho cây con hoàn chỉnh.
Văn hóa phôi Somatic:
Một phôi soma phát triển từ một tế bào soma. Mô hình phát triển của phôi soma có thể so sánh với mô hình của phôi hợp tử. Nuôi cấy phôi soma được gây ra bởi nồng độ cao của một chất phụ trợ, chẳng hạn như 2,4-D. Những phôi này phát triển thành phôi trưởng thành. Phôi soma trưởng thành hoặc phôi nảy mầm để cung cấp cho cây con hoàn chỉnh.
Thành lập trên thực địa:
Các cây con được loại bỏ khỏi các tàu nuôi cấy và được thành lập trên cánh đồng. Việc chuyển tiền này được thực hiện bằng các thủ tục cụ thể gọi là làm cứng. Trong quá trình làm cứng, cây con được giữ dưới ánh sáng giảm và độ ẩm cao. Các quy trình làm cứng làm cho cây con có khả năng chịu đựng được môi trường tương đối khắc nghiệt hơn bên ngoài các bình nuôi cấy.
Văn hóa nội nhũ:
Phương pháp nuôi cấy mô cũng được sử dụng để nuôi cấy nội nhũ. Nó là duy nhất bởi vì nó cung cấp dinh dưỡng cho phôi đang phát triển. Nó cũng là tam bội trong hiến pháp nhiễm sắc thể của nó. Cây tam bội được sử dụng để sản xuất các loại trái cây không hạt [ví dụ: táo, chuối, v.v.]. Kỹ thuật nuôi cấy nội nhũ liên quan đến các vấn đề sau:
[i] Các hạt chưa trưởng thành được mổ xẻ trong điều kiện vô trùng. Nội nhũ cùng với phôi, được cắt bỏ. Đôi khi, hạt trưởng thành cũng có thể được sử dụng.
[ii] Nội nhũ cắt bỏ được nuôi cấy trên môi trường phù hợp và phôi được loại bỏ sau khi tăng trưởng ban đầu.
[iii] Giai đoạn callus ban đầu được phát triển.
[iv] Chồi và rễ có thể phát triển và hoàn thành cây tam bội được hình thành để sử dụng tiếp.
Văn hóa Meristem:
Meristem là một nhóm các tế bào cục bộ, đang tích cực phân chia và không phân biệt nhưng cuối cùng tạo ra mô vĩnh viễn. Mặc dù cây bị nhiễm virut, nhưng mô phân sinh không có virut. Do đó, mô phân sinh có thể được loại bỏ và phát triển trong ống nghiệm để có được cây không có virut. Tu luyện mô phân sinh nách hoặc đỉnh chóp được gọi là văn hóa mô phân sinh. Các mô phân sinh đỉnh hoặc nách thường không có virus. Văn hóa Meristem liên quan đến sự phát triển của một mô phân sinh đã có sẵn và sau đó, sự tái sinh của rễ phiêu lưu từ các chồi phát triển. Nó thường không liên quan đến việc tái tạo mô phân sinh mới. Các nhà thám hiểm thường được sử dụng trong văn hóa mô phân sinh là các mẹo bắn và phân đoạn nút. Những chất giải thích này được nuôi cấy trên môi trường có chứa một cytokinin [thường là BAP]. Do đó, các cây con thu được phải chịu cứng và cuối cùng, được thiết lập trong văn hóa fisti Meristem được thực hiện trong Khoai tây, Chuối, Bạch đậu khấu, Hoa lan [giai đoạn protocorm], Mía, Dâu, Khoai lang, v.v. Nó được sử dụng trong
[i] Sản xuất các loại cây không có virut như khoai tây, mía, chuối và táo,
[ii] Bảo tồn mầm,
[iii] Sản xuất cây chuyển gen,
[iv] Nhân giống vô tính nhanh.
Văn hóa bao phấn và sản xuất đơn bội:
Một cá thể / tế bào có số lượng nhiễm sắc thể được tìm thấy trong giao tử của loài được gọi là đơn bội. Sự hình thành đơn bội được gọi là sản xuất đơn bội. Do đó các cá thể đơn bội phát sinh từ các giao tử. Một đơn bội chỉ có một bản sao của mỗi nhiễm sắc thể. Haploids là vô trùng và không có giá trị trực tiếp. Khi số lượng nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi, cây có số lượng nhiễm sắc thể bình thường cho các loài cụ thể được lấy. Những cây này là đồng hợp tử và được sản xuất trong 2-3 năm. Số lượng nhiễm sắc thể của các cây đơn bội này được nhân đôi bằng cách sử dụng colchicine để thu được các cây đồng hợp tử. Trong tự nhiên, thực vật đơn bội có nguồn gốc từ các tế bào trứng không được thụ tinh, nhưng trong phòng thí nghiệm, chúng có thể được sản xuất từ cả giao tử đực và giao tử cái. Bao phấn là một phần của hoa Angiosperms sản xuất phấn hoa [microspores], được sinh ra ở cuối nhị hoa và thường bao gồm bốn túi bào tử. Khi bao phấn của một số cây được nuôi cấy trên môi trường thích hợp để tạo ra cây đơn bội, nó được gọi là nuôi cấy bao phấn. Kỹ thuật này được phát triển bởi Guha và Maheshwari [1964], người đã nuôi cấy các bao phấn trưởng thành của Datura innoxia. Nó rất hữu ích cho việc cải thiện nhiều loại cây trồng. Nó cũng hữu ích cho sự biểu hiện ngay lập tức của các đột biến và sự hình thành nhanh chóng của purelines. Kỹ thuật này lần đầu tiên được sử dụng ở Ấn Độ để tạo ra các đơn bội của Datura. Ở nhiều loài thực vật, đơn bội cũng được tạo ra bằng cách nuôi cấy buồng trứng / noãn không thụ tinh. Đôi khi, hạt phấn hoa được tách ra khỏi bao phấn và nuôi cấy trên môi trường phù hợp.
Văn hóa phôi thai:
Nuôi cấy phôi non trên môi trường dinh dưỡng được gọi là nuôi cấy phôi. Phôi trẻ thu được từ các hạt đang phát triển. Phôi hoàn thành sự phát triển của chúng trên môi trường và phát triển thành cây con. Nhìn chung, phôi già dễ nuôi cấy in vitro hơn phôi non.