TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG
BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN DƯỢC LIỆU 1 LỚP: ĐH DƯỢC 11C
GVHD: Ths. Huỳnh Anh Duy
Nhóm 2 – Tiểu Nhóm 1: Ngô Thị Cẩm Thi Phù Thanh Thúy Vy Nguyễn Thị Tường Vy Lê Đặng Quế Trân Trần Thị Kiều Trang Huỳnh Hữu Thước
BÀI 8: DƯỢC LIỆU CHỨA COURMARIN I CƠ SỞ LÝ THUYẾT COUMARIN là các hợp chất thuộc nhóm phenylpropanoid với khung cơ bản là benzo-a-pyron, với một số tính chất sau: • Thường tồn tai dưới dạng aglycon, dể kết tinh không màu,có mùi thơm, và đa số dể thăng hoa. • Ở dạng glycosid thì có thể tan trong nước, ở dạng aglycon thì dể tan trong dung môi kém phân cực • Phát huỳnh quang dưới UV 365 nm • Do có vòng lacton nen coumarin dể bị mở vòng bởi kềm tạo thành muối tan trong nước, nếu acid hóa thì thường sẽ có sự đóng vòng
trở lại. • Sau khi mở vòng lacton bằng dung dịch kiềm, các coumarin đơn giản sẽ tạo thành dẩn chất hydroxyl cinnamic ở dang cis ,có huỳnh quang yếu trong UV 365 nm.Dưới tác dụng củ tia UV365 nm,chất này sẽ chuyển thành dạng trans, có huỳnh quang mạnh hơn. • Một số dược liệu chứa coumarin: Bạch chỉ, tiển hồ, ba dót, sài đất..
Bạch Chỉ
Tiền Hồ
Ba Dót
II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1.
DƯỢC LIỆU
a.
Bạch chỉ [Radix Angelica dahurica ]: dùng rễ
b.
Tiền hồ [Radix Peucedani]: dùng rễ
2.
Chiết xuất dược liệu: áp dụng phương pháp 1
• • •
Lấy 1g bột dược liệu [bạch chỉ, tiền hồ] cho vào bình nón 100ml, thêm 20ml cồn 96%. Đun cách thủy 5p. Lọc qua bông [trên phễu lọc], thu dịch lọc để làm phản ứng. 3.
•
•
Định tính coumarin bằng phương pháp hóa học
Phản ứng với FeCl3 Lấy 4 ống nghiệm, mỗi dược liệu 2 ống nghiệm, đánh số trên ống nghiệm: + Ống 1: cho 1ml dịch lọc + Ống 2: cho 1ml dịch lọc và 1-2 giọt dung dịch FeCl3 So sánh màu ở 2 ống nghiệm và nhận xét
Bạch chỉ Tiền hồ Nhận xét: ống 2 của mỗi dược liệu [ống thêm vài giọt FeCl 3] đều
chuyển sang màu xanh, chứng tỏ phản ứng dương tính có coumarin trong dược liệu. Ở Tiền Hồ, có màu xanh đậm hơn chứng tỏ Tiền Hồ có nhiều -OH phenol hơn Bạch Chỉ. Phản ứng đóng mở vòng lacton • Lấy 4 ống nghiệm, mỗi dược liệu 2 ống nghiệm, đánh số ống nghiệm lần lượt là 1, 2. + Ống 1: 2ml dịch lọc và 4ml nước cất, dung dịch trở nên đục.
+ Ống 2: 2ml dịch lọc và 0,5ml dung dịch NaOH 10% . Đun cách thủy trong 2 – 3 phút sau đó thêm nước cất cho đến thể tích bằng ống 1.
Bạch Chỉ Tiền Hồ Quan sát: Ở cả 2 dược liệu, ống 1 khi cho nước vào dung dịch trở nên đục, ống 2 khi cho NaOH 10% rồi đun cách thủy cho dung dịch trong hơn ống 1. Nếu tiếp tục acid hóa ống 2 bằng HCl đđ sẽ thấy 2 ống có độ đục gần nhau. Thí nghiệm này chứng tỏ cả 2 dược liệu đều có coumarin. Giải thích: lí do ống 2 trong hơn ống 1 là vì coumarin là chất kém phân cực nên khi thêm nước vào ống 1 dung dịch không tan được dẫn đến dung dịch đục, còn ống 2 khi cho NaOH vào NaOH tạo muối với coumarin [mở vòng lacton] nên dễ tan trong nước dẫn đến dung dịch trong hơn. Phản ứng với thuốc thử diazo • Lấy 2 ống nghiệm, mỗi dược liệu 1 ống. • Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc, thêm 1ml dung dịch NaOH 5%
• Đun cách thủy trong 2p, làm lạnh nhanh bằng vòi nước • Thêm từ từ từng giọt thuốc thử diazo cho đến khi xuất hiện màu đỏ hoặc đỏ cam. • Quan sát kết quả
Bạch Chỉ Tiền Hồ Nhận xét: Cả 2 dược liệu đều xuất hiện màu đỏ cam chứng tỏ 2 dược liệu đều chứa coumarin. Nhưng ở Tiền Hồ màu đỏ cam đậm hơn chứng tỏ Tiền Hồ có nhiều -OH phenol hơn Bạch Chỉ. Phản ứng huỳnh quang • Lấy 1 tờ giấy lọc cắt làm đôi, mỗi dược liệu dùng nửa tờ. • Trên nửa tờ giấy lọc kẻ 2 vòng tròn [dùng đầu ống nghiệm để vẽ] bằng nhau. • Lấy 3ml dịch lọc, thêm 3 giọt dung dịch NaOH 5% đun cách thủy trong 3p rồi nhỏ dịch lọc lên 1 trong 2 vòng tròn trên nửa tờ giấy lọc, vòng còn lại nhỏ vào dịch lọc [ban đầu chiết bằng cồn]. • Chờ cho dung môi khô rồi lặp lại như trên 4 lần nữa, để khô. • Che nữa vết dịch chiết mỗi vòng tròn bằng 1 miếng kim loại rồi đem soi đèn UV 365nm trong 1- 2 phút.
•
Lấy miếng kim loại ra sẽ thấy nữa không bị che phát quang sáng hơn nữa bị che
•
Nếu tiếp tục chiếu UV sau vài phút thì cường độ phát quang 2 nữa sẽ như nhau
Thử nghiệm vi thăng hoa • Cho 1 – 2g dược liệu [Tiền Hồ] vào 1 chén nung nhỏ. • Đun cách cát, thỉnh thoảng đảo đầu cho bay hết hơi nước rồi đậy chén bằng 1 phiến kính trên có sẵn 1 miếng bông gòn lạnh. • Tiếp tục đun khoảng 30p, để nguội.
•
Quan sát dưới kính hiển vi 10x, thấy nhiều tinh thể hình kim không màu.
•
Nhỏ vài giọt cồn 96% lên tấm lame để hòa tan các tinh thể. Chuyển dịch cồn vào ống nghiệm và làm phản ứng với thuốc thử diazo như ở phần phản ứng với thuốc thử diazo. Kết quả: dung dịch có màu đỏ cam chứng tỏ dược liệu có coumarin
• •
4. Định tính coumarin bằng sắc kí lớp mỏng
Dịch chấm sắc ký: Dịch chiết cồn của dược liệu: Tiền hồ, Bạch Chỉ được bốc hơi trên bếp cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn với CHCl3, dùng dịch này làm dịch chấm sắc ký. • Chuẩn bị bản mỏng: Lấy bản mỏng silica gel tráng sẳn với kích thước 2,5 x 10cm • Dung môi sắc ký: Hệ dung môi: S1 = n-hexan : EtOAc [9:2] Cho dung môi vào bình sắc ký [đã lót giấy lọc] sao cho lớp dung môi trong bình cao khoảng 0,5cm, đậy kính nắp bình sắc ký. • Khai triển: Dùng mao quản hút dịch chiết, chấm lên bản mỏng thành từng vạch 1-3mm cách mép dưới 1,5cm o Đặt bản mỏng vào bình sắc ký ở tư thế nghiêng 45 đậy nắp bình. Khi dung môi còn cách mép trên 0.5cm thì lấy bản mỏng ra và để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng. • Phát hiện vết: Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 365nm, UV 254nm •
UV 254nm
UV 365nm
Với thuốc thử Diazo [KOH] Nhúng bản mỏng vào dung dịch KOH 5%, rồi sấy nhẹ cho khô bản mỏng. Nhúng tiếp bản mỏng vào thuốc thử diazo [các dẫn chất coumarin sẽ cho các vết có màu cam đến đỏ], sấy khô và dán bản mỏng lại bằng keo dán. Kết quả: các vết hiện rõ và cho mảu đỏ cam với thuốc thử diazo [KOH], chứng tỏ có coumarin trong cả 2 dược liệu là Bạch Chỉ và Tiền Hồ.