Giới hạn xác định phương pháp thử hóa học năm 2024
|
cầu này không chỉ cho các phương pháp thử nội bộ mà còn cần cho các phương pháp tiêu chuẩn. Việc thẩm định phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp nội bộ có sự khác nhau, do đó cần chú ý khi lập kế hoạch thẩm định. Có hai yêu cầu chủ yếu của việc thẩm định phương pháp tiêu chuẩn:
Để xây dựng các bước thẩm định phương pháp tiêu chuẩn cần kiểm tra:
Việc đánh giá bao gồm:
3. Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn (method validation).........................................Đối với phương pháp không tiêu chuẩn, việc thẩm định phải trải qua nhiều bước hơn bắt đầu từ quá trình nghiên cứu khảo sát phương pháp, tối ưu hóa phương pháp đến khi hoàn thiện phương pháp. Thẩm định phương pháp là một yêu cầu bắt buộc phải thực hiện Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 3 đi kèm với việc phát triển phương pháp mới và áp dụng các phương pháp không tiêu chuẩn vào thực hiện thành thường quy. Các bước tiến hành thẩm định bao gồm:
Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 5 CHƯƠNG II: THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC Như đã nêu trong chương I, thẩm định phương pháp là một công việc rất khó khăn, nhàm chán, và tốn kém tuy nhiên lại là một nội dung quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích. Cần cân nhắc mục đích yêu cầu của từng phương pháp và nguồn lực để lựa chọn thông số thẩm định cho phù hợp. Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP và ICH, đối với các phương pháp phân tích hóa học các thông số cần thẩm định bao gồm:
Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng trong phương pháp, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thử nghiệm... Từng trường hợp cụ thể các thông số thẩm định có thể có sự khác nhau. Mỗi phương pháp phân tích hóa học có một mục đích nhất định, từ việc xác định một chất ở nồng độ thấp đến xác định độ tinh khiết của một chất. Để dễ dàng cho việc lựa chọn các thông số thẩm định, các phương pháp có thể được chia làm 4 nhóm tùy thuộc vào mục đích của chúng.
Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 6 Bảng 1: Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn Các thông số thẩm định Phân tích định tính Phân tích vi lượng Phân tích đa lượng Xác định giới hạn tạp chất Độ đúng (Trueness)
Độ chụm (Precision)
Độ đặc hiệu, chọn lọc (Specification/Selectivity) + + + + LOD (Limit of detection)
LOQ (Limit of quantitation)
Độ tuyến tính (Linearity/range) – + + – Độ vững (ổn định) (Ruggedness/Robustness)
(+) Cần thực hiện thẩm định (-) Không cần thực hiện thẩm định Bảng 2: Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp tiêu chuẩn Các thông số đánh giá Phân tích định tính Phân tích vi lượng Phân tích đa lượng Xác định giới hạn tạp chất Độ đúng (Trueness)
Độ chụm (Precision)
Độ đặc hiệu, chọn lọc (Specification/Selectivity) – – – – LOD (Limit of detection)
LOQ (Limit of quantitation)
Độ tuyến tính (Linearity/range) – – – – Độ vững (ổn định) (Ruggedness/Robustness)
(+) Cần thực hiện thẩm định (-) Không cần thực hiện thẩm định Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 8 thuốc thử (reagent blank), tức là thực hiện phân tích các bước tương tự như khi phân tích mẫu nhưng không có mẫu thử. Các trường hợp đặc biệt: Sắc ký lỏng sử dụng detector DAD (mảng diod) Tính chọn lọc trong sắc ký lỏng có thể đạt được thông qua việc việc lựa chọn cột tối ưu, điều kiện sắc ký tối ưu, nhiệt độ cột và bước sóng. Ngoài việc thay đổi điều kiện sắc ký, thì giai đoạn xử lý mẫu cũng phải tối ưu để đạt được tính chọn lọc cao nhất. Trong sắc ký, cần xác định rằng píc sắc ký có phải là một píc đơn hay có lẫn các tạp chất khác. Đối với các hệ thông sắc ký có detector mảng diod (DAD) có thể xác định được tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết (peak purity) của píc, hay so sánh phổ của píc với thư viện phổ sẵn có. Hình 1: Xác định độ tinh khiết của pic trong sắc ký lỏng HPLC-DAD Độ tinh khiết của píc được xác định bằng các so sánh phổ tại các điểm khác nhau trên pic sắc ký. Cách phổ biến nhất là chọn tại 3 điểm: đỉnh píc (apex), và hai điểm về hai bên sườn của píc (upslope và downslope). Thông thường chọn 2 điểm tại 2/3 độ rộng của píc về hai phía. Ngoài ra hiện nay đa số các thiết bị đều có phần mềm tính toán độ tinh khiết của píc, có thể dựa vào 3 điểm, 5 điểm, 7 điểm hay tất cả các điểm tạo thành píc. Các thiết bị hiện đại có thể tính toán độ tinh khiết trực tiếp thông qua phần mềm điều khiển. Tín hiệu Phổ Không tinh khiết Tinh khiết Độ phù hợp 999 Độ phù hợp 764 Bước sóng (nm) Bước sóng (nm) Thời gian (min) Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 9 Hình 2: Các cách xác định độ tinh khiết của pic sắc ký HPLC-DAD So sánh phổ của pic với phổ chuẩn cũng là một cách phổ biến để xác định sự tinh khiết của píc. Một píc được xem là không tinh khiết khi giá trị phù hợp (hệ số match) không đạt xấp xỉ 100%. Tuy nhiên, nếu giá trị này có gần 100% cũng không thể khẳng định được chắc chắn sự tinh khiết của píc, có thể do một trong số các nguyên nhân sau:
Sắc ký khối phổ Các thiết bị sắc ký khí có gắn detector MS, thường so sánh phổ của chất phân tích với phổ chuẩn có sẵn trong thư viện đi kèm hoặc phổ của chất chuẩn tương ứng. Sử dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) đối với các phương pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất. Cách tính điểm IP đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau được quy định như sau: Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 11 Các thiết bị sắc ký khí có gắn detector MS, thường so sánh phổ của chất phân tích với phổ chuẩn có sẵn trong thư viện đi kèm hoặc phổ của chất chuẩn tương ứng. Ví dụ: Phương pháp phân tích chloramphenicol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần, người ta thực hiện bắn phá ion mẹ m/z 321 và định lượng theo ion con tạo thành là 152 và 194. Theo cách tính điểm IP thì với 1 ion mẹ và 2 ion con thu được 4 điểm IP, như vậy phương pháp có tính đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu. Cần thực hiện thêm các phép thử trên mẫu trắng (n6) và mẫu có nồng độ gần LOQ (n6) để xác định chắc chắn phương pháp có tính đặc hiệu cao. Tính đặc hiệu/chọn lọc đối với phương pháp chuẩn: Đối với các phương pháp chuẩn, như đã nêu trong bảng 2, thông thường không cần xác định tính đặc hiệu/chọn lọc. Tuy nhiên, cần cân nhắc thực hiện việc xác định độ đặc hiệu trong các trường hợp sau:
2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn....................................................................................Định nghĩa: Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính như đã nêu. Để đơn giản hơn, hai khái niệm này được mô tả trong hình 3 dưới đây: Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật 12 Hình 3: Khoảng tuyến tính (linear range) và khoảng làm việc (working range) Cách xác định khoảng tuyến tính: Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác định khoảng tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau. Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ và quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc và nhiều yếu tố trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng. Các chất khác nhau có khoảng tuyến tính khác nhau do sự khác nhau về tính chất lý hóa. Trong khi các kỹ thuật sử dụng khác nhau ảnh hưởng lớn đến độ dài ngắn của khoảng tuyến tính. Ví dụ, kỹ thuật HPLC nếu sử dụng detector UV-Vis hoặc DAD có thể cho khoảng tuyến tính đến 10 6 thậm chí đến 10 7 , trong khi nếu sử dụng detector huỳnh quang hay chỉ số khúc xạ thì chỉ cho khoảng tuyến tính khoảng 10 4 – 10 5. Xây dựng đường chuẩn: Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn. |
